狼源性成分探針法熒光定量PCR試劑盒?檢測方法步驟

狼源性成分探針法熒光定量PCR試劑盒檢測方法步驟：

(1)將參照基因與待測目的基因片段等比例連接，克隆到同一個質粒載體上，構建一種可同時用于參照基因以及待測目的基因擴增檢測的標準品，并將所得標準品按照濃度梯度稀釋后同時用于繪制參照基因以及待測目的基因的標準曲線；

(2)待測樣本與步驟(1)所述標準品經(jīng)同步進行實時熒光定量PCR擴增后，目的基因與參照基因按照各自的標準曲線計算各自的拷貝數(shù)，計算待測樣本的目的基因與參照基因拷貝數(shù)比值，即得目的基因的拷貝數(shù)相對定量檢測結果。

其中步驟(1)為：將參照基因與待測目的基因片段等比例連接，克隆到同一個質粒載體上，構建一種可同時用于參照基因以及待測目的基因擴增檢測的標準品，并將所得標準品按照濃度梯度稀釋后同時用于繪制參照基因以及待測目的基因的標準曲線。

其中所述參照基因為本領域常規(guī)參照基因，較佳地管家基因，優(yōu)選地為RPPH1的擴增區(qū)域，其中所述質粒載體為本領域常規(guī)質粒載體，較佳地為PCR克隆載體，優(yōu)選地為TA cloning載體，所述TA cloning載體較佳地為pMD18-T載體。其中所述標準品的核酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示。所述的等比例較佳地為1：1。由于標準品中待測目的基因與參照基因的比例為1:1，解決了目前相對標準曲線法應用中目的基因與參照基因的濃度比例關系難以控制的問題，提高HER2基因擴增檢測的可靠性。

步驟(2)為：待測樣本與步驟(1)所述標準品經(jīng)同步進行實時熒光定量PCR擴增后，目的基因與參照基因按照各自的標準曲線計算各自的拷貝數(shù)，計算待測樣本的目的基因與參照基因拷貝數(shù)比值，即得目的基因的拷貝數(shù)相對定量檢測結果。

其中所述待測目的基因為本領域常規(guī)待測目的基因，較佳地為腫瘤或者疾病的特異性基因，更佳地為HER2基因的擴增區(qū)域，所述熒光定量PCR擴增為本領域常規(guī)熒光定量PCR擴增方法，所述熒光定量PCR擴增方法較佳地為多通道熒光定量PCR擴增，更佳地為雙通道熒光定量PCR擴增。

NRK-52E，大鼠腎細胞

H9c2大鼠心肌細胞（ATCC來源）

C2C12, 小鼠肌原細胞

NIH/3T3, 小鼠成纖維細胞系

大鼠骨髓間充質干細胞（BMSCs）

HSC-T6, 大鼠肝星狀細胞系

CHO, 中國倉鼠卵巢細胞系

COS-7L, 非洲綠猴腎成纖維細胞

SF9, 昆蟲卵巢細胞

BRL 3A, 大鼠肝正常細胞

HK-2, 人腎皮質近曲小管上皮細胞

HET-1A, 人食管上皮細胞

RGC-5, 小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞

GC-1, 鼠精原細胞

293A，人胚腎上皮細胞系（腺病毒包裝級別）

hDPSCs, 人前磨牙牙髓干細胞

293T, SV40轉化的人胚腎上皮細胞系

EPC, 大鼠血管內(nèi)皮祖細胞

HBE, 正常人支氣管上皮細胞系

HL-02 [L-02,HL-7702], 正常人肝上皮細胞

HUVEC-12, 人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞系

HUM, 正常人主動脈平滑肌細胞

HAVSMC, 人主動脈平滑肌細胞

LX-2, 人肝星形細胞株

3T3-L1, 小鼠前脂肪細胞