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    PCR擴增試劑盒引物設(shè)計應(yīng)遵循的原則

    更新時間:2022-08-25點擊次數(shù):935
       PCR擴增試劑盒應(yīng)用前要計算好各試劑的使用量,加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中,充分混勻,10000rpm離心10s,向設(shè)定的N個PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液,向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL,10000rpm瞬時離心10秒。
      引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵,PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈做引物,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。
      設(shè)計引物遵循的原則如下:
      1.引物長度:15-30bp,常用為20bp左右。
      2.引物擴增跨度:以200-500bp為宜,特定條件下可擴增長至10kb的片段。
      3.引物堿基:G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴增效果不佳,G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC隨機分布,避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
      4.避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu),避免兩條引物間互補,特別是3'端的互補,否則會形成引物二聚體,產(chǎn)生非特異的擴增條帶。
      5.引物3'端的堿基,特別是末及倒數(shù)第二個堿基,應(yīng)嚴(yán)格要求配對,以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。
      6.引物中有或能加上合適的酶切位點,被擴增的靶序列有適宜的酶切位點,這對酶切分析或分子很有好處。
      7.引物的特異性:引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。
      8.引物量:每條引物的濃度0.1-1umol或10-100pmol,以引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好,引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增,且可增加引物之間形成二聚體的機會。

    TEL:021-61210612

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