注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
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實(shí)驗(yàn)過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲(chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。
BBIH乙酸香葉酯 96%2,6-二氟-4-羥基苯 98%

Hoechst 33342乙酸葉酯 98%2,4-二甲酸 98%

Fluorescein正己 Standard for GC,>99.5%(GC)L-蘋果酸二甲酯 98%

Fluorescein disodium salt正己 98%2,2-二甲基丁酸 98%

DAPI正己 分析標(biāo)準(zhǔn)品,>99.8%(GC)3,3-二甲基烯酸 98%

Phelphthalein正己 99%2,5-二甲酸 98%

Phelphthalein test paper正庚酸 Standard for GC3,5-二甲基-4-吡唑 97%

Phelphthalexone正庚酸 AR,98.0%2,5-二甲基溴苯 98%

Thymol正庚酸 分析標(biāo)準(zhǔn)品N-基二硫代亞胺碳酸二甲酯 90%

Rhodamine 123正己酸 Standard for GC, ≥99.5% (GC)L-(-)-二(對(duì)甲酰) 97%

Rhodamine B正己酸 CP,98.0%        3-(二甲氨基)烯酸乙酯 98%

TMB正己酸 分析標(biāo)準(zhǔn)品3-氨基巴豆酸乙酯 99%

3,3,5,5-Tetramethyl benzidine solution liquid-1 component正己酸 AR,99.0%硫代草氨酸乙酯 95%

3,3,5,5-Tetramethyl benzidine solution liquid membrane substrate己酸葉酯 98%乙酸乙酯 98%

TMB•2HC1己酸葉酯 98%，Kosher 二乙酯 97%

TMB-US(ultra sensitive) solution正庚 Standard for GC,>99.5%(GC)3-(5-乙基-1,2,4-噁二唑-3-基)苯甲酸 97%

D-泛酸鈣,維生素B5Immufluorescence Antibody Dilution BufferRBBP6/P2P-R  增殖潛能相關(guān)蛋白抗體

脫羧氯雷他定/地氯雷他定AUF1/hnRNP D (D6O4F) Rabbit mAbRBBP6  視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤結(jié)合蛋白6抗體

脫羧氯雷他定/地氯雷他定(標(biāo)準(zhǔn)品)PathScan® Total Caveolin-1 Sandwich ELISA KitRBBP5  視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤結(jié)合蛋白5抗體

地塞米松磷酸鈉UHRF1 (D6G8E) Rabbit mAbRbAp48  視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤結(jié)合蛋白P48抗體

地塞米松磷酸鈉（標(biāo)準(zhǔn)品）BackDrop® Green Background SuppressorRB1CC1  RB1的誘導(dǎo)卷曲蛋白R(shí)B1CC1抗體

磷酸奧司他韋GFAP (D1F4Q) XP® Rabbit mAbRb/P105 RB  成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤基因抗體

磷酸奧司他韋(標(biāo)準(zhǔn)品)GFAP (D1F4Q) XP® Rabbit mAbRat secretory IgA  分泌型免疫球蛋白A抗體

鹽酸地布卡因YAP (1A12) Mouse mAbRASSF8  RAS家族關(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域蛋白8抗體

多奈哌齊BNIP3L/Nix (D4R4B) Rabbit mAbRASSF7  RAS家族關(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域蛋白7抗體

多尼培南(標(biāo)準(zhǔn)品)Phospho-DNAJC2/MPP11 (Ser47) AntibodyRASSF6  RAS家族關(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域蛋白6抗體
產(chǎn)紫青霉PCR檢測試劑盒規(guī)格人利什曼原蟲抗體(LeishimariaAb)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：50克

人粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：RT10克

人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：1米

人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子抗體(GM-CSFAb)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：2～8℃100毫升

人粒細(xì)胞趨化蛋白-2(GCP-2/CXCL6)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：RT支

人粒細(xì)胞特異性抗核抗體(GS-ANA)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：2～8℃100毫升

人痢疾內(nèi)阿米巴抗原ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：1克

人鏈激酶(SK)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：RT25克
檢測步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽性對(duì)照)，每個(gè)測試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽性對(duì)照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。