馬流產沙門氏菌PCR檢測試劑盒說明書

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注意事項：1．基礎程序；2．擴增溫度和延伸溫度；3．反應時間；4．循環次數；5．PCR 反應液的配制；6．PCR技術的基本原理；7．PCR的反應動力學；8．PCR擴增產物；9．PCR反應體系與反應條件。

實驗過程：
一、試劑準備
1. DNA模板
2．對應目的基因的特異引物（在PCR反應中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續按照模板DNA復制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設計的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據你的模板鏈設計。因此，擴增不同的基因需要設計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進入循環擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結束反應，PCR產物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進行抽提反應混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
１．PCR反應應該在一個沒有DNA污染的干凈環境中進行設立一個的PCR實驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應戴手套。
４．PCR試劑配制應使用zui高質量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續性。
６．試劑或樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應在冰浴上化開，并且要充分混勻。檢測步驟：
一、 試劑的準備
從試劑盒中取出熒光PCR反應液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設所需要的PCR反應管管數為N(N=樣本數+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個測試反應體系配制如下表：
試劑 每個反應加入的量 N個反應加入的量
熒光PCR反應液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設定的N個PCR反應管中分別加入15μL熒光PCR反應液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時離心10秒。
7.2 qPCR反應條件
將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內。
推薦循環條件:
1循環 50℃ for 2 min
預變性 1循環 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時收集熒光信號。報告基團：設置為FAM。淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。
組成及試劑配制:
1、酶標板：一塊（96孔）
2、 標準品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標準品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標準品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
Hirudin recombinant無氯化鈣 AR,96.0%正己烷 AR，97%

rhIL-1ra無氯化鈣 CP,96.0%正己烷 for GC, ≥99.0% (GC)

rhG-CSF無氯化鈣 ACS正己烷  >99%(GC)

Iodoacetic acid無氯化鈣 99.99% metals basis正己烷 農殘級, ≥98.0% (GC)

Bis(2-ethylhexyl) Azelate檸檬酸,一 99.995% metals basis正己烷 光譜純, ≥98.0% (GC)

DPRP尼泊金乙酯 AR,99%正己烷 分析標準品，>99.5%（GC)

DIBP硫酸亞鐵，七 AR正己烷 ACS,>98.5%(GC)

DNHP硫酸亞鐵，七 99.99% metals basis異 AR, ≥99.5%

Diphenyl phthalate硫酸亞鐵，七 ACS, ≥99.0%異 ACS 光譜級, ≥99.5%

Shanzhisize methyl ester硫酸亞鐵，七 for plant cell culture, ≥99% AR,98.0%（）

Triethyl phosphite檸檬酸 CP,99.0% CP，99.5%

Gly-Pro-AMC鈉石灰 醫用級，紅色 99.995% tmetals basis

3,5-Dimethylphel鈉石灰(帶指示劑) ACS乙酰乙酸甲酯  99%

3′-Nitroacetophene鈉石灰 CP正辛酸 standard for GC, ≥99.5% (GC)

3-Amibenzeneboronic acid乙酸鈉，三 CP,98%正辛酸 CP,98%

4-Vinylphenylboronic acid酸銨 AR,97%正辛酸 分析標準品，≥99.9%(GC)

司班80;司盤80STAM2 Antibodyphospho-STAT5a(Tyr694)  磷酸化信號轉導和轉錄激活因子5a抗體

聚乙二1000Sec24C (D9M4N) Rabbit mAbphospho-STAT5a(Ser780)  磷酸化信號轉導和轉錄激活因子5a抗體

胰蛋白胨(BD)Phospho-ALK (Tyr1507) (D6F1V) Rabbit mAbphospho-STAT5a(Ser726)  磷酸化信號轉導和轉錄激活因子5a抗體

丹磺酰氯Mo-Methyl Lysine [mme-K] MultiMab™ Rabbit mAb mixPhospho-Stat4 (Tyr693)  磷酸化信號轉導和轉錄激活因子4抗體

N-乙基順二酰亞胺Tri-Methyl Lysine Motif [tme-K] (D1L1X) Rabbit mAbphospho-STAT3 (Tyr705)  磷酸化信號轉導和轉錄激活因子3抗體

碳酸氫(AR)Dinitrophel (D1D6) Rabbit mAbphospho-STAT3 (Ser727)  磷酸化信號轉導和轉錄激活因子3抗體

十二烷基磺酸鈉(BR)Digoxigenin (D8Q9J) Rabbit mAbPhospho-Stat2 (Tyr690)  磷酸化信號轉導和轉錄激活因子2抗體

茶堿Na Channel β1 Subunit (D9T5B) Rabbit mAbphospho-STAT1 (Tyr701)  磷酸化信號轉導與轉錄激活因子1抗體

纖維素酶MRP1/ABCC1 (D7O8N) Rabbit mAbphospho-STAT1 (Ser727)  磷酸化信號轉導與轉錄激活因子1抗體

硫酸軟骨素Na Channel β2 Subunit (D1S8E) Rabbit mAbPhospho-SRF (Ser77)   磷酸化生長激素釋放因子抗體(血清應答因子)
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