大豆內源基因PCR檢測試劑盒說明書

注意事項：1．基礎程序；2．擴增溫度和延伸溫度；3．反應時間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應液的配制；6．PCR技術的基本原理；7．PCR的反應動力學；8．PCR擴增產物；9．PCR反應體系與反應條件。

組成及試劑配制:
1、酶標板：一塊（96孔）
2、 標準品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標準品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標準品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
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實驗過程：
一、試劑準備
1. DNA模板
2．對應目的基因的特異引物（在PCR反應中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設計的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設計。因此，擴增不同的基因需要設計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結束反應，PCR產物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進行抽提反應混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
１．PCR反應應該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進行設立一個的PCR實驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應戴手套。
４．PCR試劑配制應使用zui高質量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應在冰浴上化開，并且要充分混勻。
PMSF叔丁基異硫酸酯  99%氮標準溶液5ng/ml,基體:輕油

Calcium hydrogenphosphate dihydrate巰基乙酸乙酯 98%氮標準溶液10ng/ml,基體:輕油

Calcium carbonate3-巰基酸 98%氮標準溶液50ng/ml,基體:輕油

Calcium oxide巰基乙酸甲酯 96%氮標準溶液100ng/ml,基體:輕油

Calcium fluoride硫代乙酸鈉 AR,80.0%氮標準溶液200ng/ml,基體:輕油

Calcium Hydroxide硫代乙酸鈉 BR二十八烷 standard for GC, ≥98.5% (GC)

Calcium hypophosphite硫代乙酸鈉 98%麗春紅S Biological stain

Calcium hypophosphite mohydrate松油,異構體混合物,CP炔 Standard for GC（）

Acid calcium phosphate硬酯酸乙酯 97%胡椒 CP,99.0%（易制）

Calcigel simple油酸甲酯 CP，≥60.0% (GC)聚乙二400 色譜固定液，60℃+++++

Calcium pyrophosphate油酸甲酯 分析標準品，>99.0%(GC)羅丹明B AR

Calcium silicate油酸甲酯 99%癸二酸 色譜固定液，155℃

Calcium acetate mohydrate油酸甲酯 96%無碳酸鈉 AR

Glycerol phosphate calcium salt油酸甲酯 Standard for GC,≥99%(GC)司班60 色譜固定液

Calcium oxalate異抗壞血酸鈉 98%硫標準溶液 輕質礦物油中硫標準品，100ng/ml

Calcium stearate4-(2-氨乙基)苯磺酰胺  99%硫標準溶液 1000ug/ml，基體:1%HCl

1-十四烯(>99.5%(GC),標準物質)Snail (L70G2) Mouse mAbKidins220  220kDa蛋白激酶D相互作用蛋白抗體

1-十五烯(>99.0%(GC)，標準物質)Human Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)KIAA1576/VAT1L  囊泡胺轉運蛋白1家族蛋白抗體

1-十六烯(>99.5%(GC),標準物質)PARN (P620) AntibodyKIAA1522  KIAA1522蛋白抗體

1-十七烯(>99.5%(GC),標準物質)PTMScan® Lys-C ProteaseKi-67 (Proliferation Marker)  Ki67蛋白抗體

1-十九烯(>99.5%(GC),標準物質)Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype ControlKGF/FGF7  纖維母細胞生長因子7抗體

4-溴苯乙酰溴(>99.0%(T),用于高效液相色譜標記)Phospho-Bcr (Tyr177) AntibodyKF1/ZFP103  鋅指蛋白103抗體

N-氯甲基-4-硝基鄰苯二甲酰亞胺(>98.0%(T))Bcr AntibodyKetohexokinase  肝果糖激酶抗體

N-氯甲基-4-硝基鄰苯二甲酰亞胺(>98.0%(T))Acetyl-Histone H3 (Lys27) (D5E4) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate)Keratocan  細胞角膜蛋白多糖抗體

3'-甲氧基苯乙酰溴(>99.0%(T))VCAM-1 (D8U5V) Rabbit mAb (Mouse Specific)Keratan Sulfate  硫酸角質素抗體

N,N'-二異基-O-(4-甲基)異脲(>95.0%(HPLC))Gα(z) AntibodyKEAP1/KLHL19  胞質接頭蛋白Keap1抗體
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檢測步驟：
一、 試劑的準備
從試劑盒中取出熒光PCR反應液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設所需要的PCR反應管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個測試反應體系配制如下表：
試劑 每個反應加入的量 N個反應加入的量
熒光PCR反應液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設定的N個PCR反應管中分別加入15μL熒光PCR反應液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時離心10秒。
7.2 qPCR反應條件
將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時收集熒光信號。報告基團：設置為FAM。淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。