副豬嗜血桿菌定量PCR檢測試劑盒說明書

組成及試劑配制:
1、酶標板：一塊（96孔）
2、 標準品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標準品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標準品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
注意事項：1．基礎程序；2．擴增溫度和延伸溫度；3．反應時間；4．循環次數；5．PCR 反應液的配制；6．PCR技術的基本原理；7．PCR的反應動力學；8．PCR擴增產物；9．PCR反應體系與反應條件。

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實驗過程：
一、試劑準備
1. DNA模板
2．對應目的基因的特異引物（在PCR反應中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續按照模板DNA復制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設計的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據你的模板鏈設計。因此，擴增不同的基因需要設計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進入循環擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結束反應，PCR產物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進行抽提反應混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
１．PCR反應應該在一個沒有DNA污染的干凈環境中進行設立一個的PCR實驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應戴手套。
４．PCR試劑配制應使用zui高質量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續性。
６．試劑或樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應在冰浴上化開，并且要充分混勻。檢測步驟：
一、 試劑的準備
從試劑盒中取出熒光PCR反應液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設所需要的PCR反應管管數為N(N=樣本數+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個測試反應體系配制如下表：
試劑 每個反應加入的量 N個反應加入的量
熒光PCR反應液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設定的N個PCR反應管中分別加入15μL熒光PCR反應液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時離心10秒。
7.2 qPCR反應條件
將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內。
推薦循環條件:
1循環 50℃ for 2 min
預變性 1循環 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時收集熒光信號。報告基團：設置為FAM。淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。
吉非替尼C24H34O4基*基硅烷

吉非替尼(標準品)C27H32O16基三氧基硅烷

鹽酸吉西他濱C20H20O45-溴-2-甲酸甲酯

鹽酸吉西他濱（標準品）C19H20O65--2-基-3H-咪唑-甲

甲磺酸吉米沙星C30H26O132,6-二甲酰

甲磺酸吉米沙星（標準品）C51H84O22間羥基酮

膽酸鈉C20H26O4氨基-三氟甲

醋酸胰高血糖素C15H20O3氟-2-羥基甲

醋酸戈那瑞林C28H44O38-氨基萘磺酸

鹽酸格拉司瓊C16H20O9-5-甲氧基

鹽酸格拉司瓊（標準品）C16H12O4氨基-5--2-氧基甲酸

氫噻C54H92O23坎利酮

氫噻（標準品）C53H90O222,5-二磺酰

醋酸C53H90O22溴-2-

醋酸（標準品）C42H72O142--氟

鹽酸伊達比星C42H72O13酰酮鋅（無水）

甲磺酸伊馬替尼C36H62O9吲哚-羧酸

甲磺酸伊馬替尼（標準品）C20H24NO42-異基-6-甲基-吡啶

豬B細胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)ELISA試劑盒phospho-ADRB2(Ser346)  酸化腎上腺素能受體β2100 ul

豬Bcl-2相關X蛋白(BAX)ELISA試劑盒ADRB3  β3-腎上腺素能受體100 ul

豬Apelin(APLN)ELISA試劑盒AE3/SLC4A3  陰離子交換蛋白31 Kit

豬5羥色(5-HT)ELISA試劑盒AEBP1   脂肪細胞增強結合蛋白1100 ul

豬Ⅲ型前膠原肽(PⅢNP)ELISA試劑盒AF6/Afadin  絲狀肌動蛋白結合蛋白100 ul

豬Ⅲ型前膠原氨基末端肽(PⅢNP)ELISA試劑盒phospho-Afadin(Ser1718)  酸化絲狀肌動蛋白結合蛋白100 ul

豬Ⅲ型前膠原氨基端肽(PⅢNT)ELISA試劑盒alpha-L-arabinofuranosidase  果桃α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶100 ul

豬Ⅲ型膠原(Col Ⅲ)ELISA試劑盒AFP  甲胎蛋白100 ul

豬25羥基維生素D3(25 HVD3)ELISA試劑盒AFP  甲胎蛋白（包被）100 ul
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