綠膿桿菌PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml。
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實(shí)驗(yàn)過(guò)程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開(kāi)，并且要充分混勻。
熊果酸Bcl-xL (54H6) Rabbit mAb (APC Conjuga)紅色基ITR(氨基-甲氧基-N,N-二基磺酰)

熊果酸；烏蘇酸(標(biāo)準(zhǔn)品)Aurora A (1F8) Mouse mAb5-溴-2,二吡啶

香葉木素SGK1 (D27C11) Rabbit mAb1-氨基-1-環(huán)丁基羧酸鹽酸鹽

香葉木素（標(biāo)準(zhǔn)品）SignalSilence® SP1 siRNA I氨基-3,5-二吡啶

金雀花,野靛Bak (D4E4) Rabbit mAb(R)-吲哚啉-2-羧酸

金雀花,野靛（標(biāo)準(zhǔn)品）Bak (D4E4) Rabbit mAb間三氟酚

厄貝沙坦SignalSilence® SP1 siRNA II2-氨基-磺酰基酚

5'-O-(4,4'-二甲氧基三基)-胸苷-3'-O-丁二酸Bora (D2B9) Rabbit mAb(叔丁氧羰基氨基)吡啶

水楊苷Phospho-MEK1/2 (Ser221) Blocking Peptide2,二-5-甲氧基

水楊苷(標(biāo)準(zhǔn)品)Phospho-MERIT40 (Ser29) Antibody砜

厚樸酚PathScan® Phospho-Acetyl-CoA Carboxylase (Ser79) Chemiluminescent Sandwich ELISA Kit2'-氟-4'-羥基酮

厚樸酚(標(biāo)準(zhǔn)品)ITCH (D8Q6D) Rabbit mAb(1S)-1-(2R)-環(huán)氧基-2-基氨酸叔丁酯

埃索美拉唑鎂(三水)Bcl-11B (D6F1) XP® Rabbit mAb1-N-Boc-氧代-哌啶羧酸酯

蘆丁/蕓香葉苷Bcl-11B (D6F1) XP® Rabbit mAb1-Boc-哌啶酮

蘆丁/蕓香葉苷(標(biāo)準(zhǔn)品)Lapatinib2-萘甲酰

新橙皮苷二氫查爾酮WIPI1 Antibody2,二-5-硝基吡啶

新橙皮苷二氫查爾酮(標(biāo)準(zhǔn)品)Phospho-ALK (Tyr1078) (D28B4) Rabbit mAb5-溴-2-吡啶

氧化苦參SignalSilence® Cbl-b siRNA I2-溴-5-硝基-6-甲基吡啶

1,25二羥基維生素D3(1,25 DHVD3)ELISA試劑盒DRD5/Dopamine Receptor D5  多巴受體D5100 ul

兔ELISA試劑盒DBC1  膀胱癌缺失基因1100 ul

兔膠原吡啶交聯(lián)(PYD)ELISA試劑盒Phospho-DBC1 (Thr454)  酸化膀胱癌缺失基因1100 ul

兔降鈣素原(PCT)ELISA試劑盒DBH  多巴β羥化酶100 ul

兔降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)ELISA試劑盒DCC  結(jié)腸直腸癌缺失基因100 ul

兔甲狀旁腺激素(PTH)ELISA試劑盒DCIR/CLEC4A  C型凝集素結(jié)構(gòu)域家族4成員A100 ul

兔基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1/CXCL12)ELISA試劑盒DCN/Decorin   核心蛋白聚糖100 ul

兔基質(zhì)金屬蛋白酶2/明膠酶A(MMP-2/Gelatinase A)ELISA試劑盒CLEC5A/MDL1  C型凝集素結(jié)構(gòu)域家族5成員A100 ul

兔基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP-1)ELISA試劑盒LAMP-3/DC-LAMP/CD208  CD20820 ul
綠膿桿菌PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)鈣通道電壓依賴性β1蛋白抗體Bergapten中文名：佛手柑內(nèi)酯別名：分子式：C12H8O4

酸性線粒體肌酸激酶抗體Angelicin中文名：別名：分子式：C11H6O3

肌肽二肽酶1抗體Psoralen中文名：補(bǔ)骨脂素別名：分子式：C11H6O3

膠原樣蛋白抗體Fraxidin中文名：嗪皮啶別名：分子式：C11H10O5

20號(hào)染色體開(kāi)放閱讀框72抗體Agrimolide中文名：仙鶴草內(nèi)酯別名：分子式：C18H18O5
檢測(cè)步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照)，每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽(yáng)性對(duì)照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。