組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
注意事項：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動力學(xué)；8．PCR擴增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

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實驗過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此，擴增不同的基因需要設(shè)計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進行設(shè)立一個的PCR實驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。檢測步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個測試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個反應(yīng)加入的量 N個反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時收集熒光信號。報告基團：設(shè)置為FAM。淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。
肝素鈉/肝脂鈉鹽C16H24NO5.S1-基-1H-吡唑-甲

羥基-β-環(huán)糊精C15H8O7-羥基甲

奈福泮/鹽酸平痛新C21H22O6(三氟甲基)酸頻哪酯

甲氨蝶呤二鈉鹽 C23H34O55-基噻吩-2-酸

甲氨蝶呤二鈉鹽 (標(biāo)準(zhǔn)品)C27H30O17雙(三氟磺酸)二丁錫

鹽酸沙氟沙星;鹽酸沙拉沙星C27H45NO2巰基甲酸

鹽酸沙氟沙星;鹽酸沙拉沙星(標(biāo)準(zhǔn)品)C14H18N2O22-溴-5-氟酚

甲硫二馬尼/二馬尼甲硫酸鹽C48H80O175-降冰片-2-甲

甲硫二馬尼(標(biāo)準(zhǔn)品)C44H70O172-氧基酰

TBTU，O-并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟酸酯C44H70O18亞酸二異酯

吡-2-羧酸，吡單羧酸C39H62O141,二胍硫酸鹽

異丁基酸C15H18O2四熒光素

達(dá)格列;達(dá)格列凈C26H28O13對甲磺酸己酯

甘草查而酮 A(標(biāo)準(zhǔn)品)C32H40O8八氟己二酸二甲酯

三卡班C20H30O12透明質(zhì)酸,從雞冠花所得

吩;法齊明C26H28O13亞酸三鄰甲酯

法齊明（標(biāo)準(zhǔn)品）C24H26O14(基甲基)吡啶

聚吡咯烷酮,PVP-K15C22H30O14-2-鹽酸鹽

白蛋白ELISA試劑盒Phospho-Cytokeratin 17 (Ser44)  酸化細(xì)胞角蛋白1720 ul

氧化酶(含黃素)A(MAOA)ELISA試劑盒CK19  細(xì)胞角蛋白19100 ul

癌胚抗原(CEA)ELISA試劑盒CK19  細(xì)胞角蛋白191 Kit

阿立新A(Orexin A)ELISA試劑盒CK20  細(xì)胞角蛋白20100 ul

γ突觸核蛋白(SNCG)ELISA試劑盒CK1/8/19  細(xì)胞角蛋白1/8/19100 ul

γ干擾素誘導(dǎo)蛋白16/p16(IFI16/p16)ELISA試劑盒CK2  細(xì)胞角蛋白2500 ul

γ干擾素受體(IFN-γR)ELISA試劑盒CK3  細(xì)胞角蛋白3100 ul

γ干擾素(IFN-γ)ELISA試劑盒CK4  細(xì)胞角蛋白4500 ul

γ分泌酶ELISA試劑盒CK5  細(xì)胞角蛋白5100 ul
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