腦膜炎病毒多重PCR檢測(cè)試劑盒廠家

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注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

實(shí)驗(yàn)過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。檢測(cè)步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽性對(duì)照)，每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽性對(duì)照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。
組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml。
吲哚(>98%,BR)Smad2/3 Antibody Sampler Kit2,5-二甲基-2,5-二(叔丁基過氧基)己烷

硫酸鋰(>98%,BR)Pan-Actin (D18C11) Rabbit mAb (HRP Conjuga)三羥甲基硝烷

硫柳汞鈉鹽LRIG1 Antibody三氟溴

硅粉(>99%，BR)K252a內(nèi)向-氨基-9-甲基-9-氮雜雙環(huán)[3,3,1]壬烷

油酸鈉(>98%,BR )SignalFire™ Eli ECL Reagent甲基*基硅烷

四甲基化銨(>99%,BR)SignalFire™ Eli ECL Reagent1-溴--2-甲基烷

1-辛烷磺酸鈉(>98%,BC )Thapsigargin(S)-2-甲基-CBS-惡唑烷

2,3,5*酸(>97%,植物激素級(jí))SMARCC2/BAF170 (D8O9V) Rabbit mAbS-(-)-1,2-環(huán)氧烷

吲哚丁酸(>98%,植物激素級(jí))SHMT2 Antibody4,二異酸酯二環(huán)己烷

酸鈣一水(>98%,BR)SignalSilence® AUF1/hnRNP D siRNA I1,二溴-2,2-二甲氧基烷

酸三鈣(>98%,BR)PiT1/SLC20A1 (D1Z4X) Rabbit mAb二溴二氟

DL-硒代蛋氨酸(USP)RBBP5 (D4Y7R) Rabbit mAb1,2-二(二基膦基)烷

蜜二糖DMF (Dimethylformamide)二

草酸鈉(>98%，BC)Cleaved Caspase-3 (Asp175) (D3E9) Rabbit mAb (PE Conjuga)二基

鎢酸鈉二水(>98%,BR)SimpleChIP® Human tRNA-Leu Anti-Codon (TAG) Primers兒茶酚烷

丁二酸酐(>98%,BR)S-Tag (D2K2V) XP® Rabbit mAb(S)-2-(氨甲基)-1-基吡咯烷

四基化銨(>98%,BR)Malachi Green Phospha Dection Kit1-氧基-1-*硅氧基環(huán)烷

吐溫60FGF Receptor 1 (D8E4) XP® Rabbit mAb (PE Conjuga)(S)-氨基吡咯烷

結(jié)合珠蛋白/觸珠蛋白(Hpt/HP)ELISA試劑盒ET-1  內(nèi)皮素-1100 ul

結(jié)締組織活化肽Ⅲ(CTAPⅢ)ELISA試劑盒ET-1  內(nèi)皮素-120 ul

結(jié)蛋白(DES)ELISA試劑盒ET-1(whole serum)  內(nèi)皮素-1（抗血清）100 ul

結(jié)蛋白(Des)ELISA試劑盒Ets1/ETS-1  Ets轉(zhuǎn)錄因子家族e(cuò)ts1100 ul

角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)ELISA試劑盒ETK/BMX  非受體性蛋白酪氨酸激酶ETK100 ul

角化細(xì)胞內(nèi)分泌因子(KAF)/雙調(diào)蛋白(AR)ELISA試劑盒Phospho-ETK (Tyr40)  酸化非受體性蛋白酪氨酸激酶ETK100 ul

膠轉(zhuǎn)蛋白(TAGLN)ELISA試劑盒Eukaryotic aspartyl proase(Rice)  天冬氨酸蛋白酶家族蛋白(水稻蛋白的一種)100 ul

膠質(zhì)細(xì)胞系來源的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)ELISA試劑盒EV71 VP1  腸道病毒71型/手足口病病毒100 ul

膠原吡啶交聯(lián)(PYD)ELISA試劑盒EV71 VP1 (CT)  腸道病毒71型/手足口病病毒(C端)100 ul
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