組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
注意事項：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動力學(xué)；8．PCR擴增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

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實驗過程：
一、試劑準備
1. DNA模板
2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此，擴增不同的基因需要設(shè)計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進行設(shè)立一個的PCR實驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。檢測步驟：
一、 試劑的準備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個測試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個反應(yīng)加入的量 N個反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時收集熒光信號。報告基團：設(shè)置為FAM。淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。
FMOC-C1脫落酸（合成） 99%異丁酸異丁酯 98%

TBTUDL-氨酰-DL-氨酸 97%己酸異丁酯 98%

Amimethyl resin親合素 12 U/mg 丁酸甲酯 99%

2-Chlorotrityl chloride resin1-萘胺-5-磺酸 90%異丁酸甲酯 99%

Hydroxymethyl resin抗壞血酸 分析標(biāo)準品異丁酸甲酯 ≥99%,Kosher

MBHA resin抗壞血酸 ≥99.9998% (metals basis)2-甲基丁基乙酸酯 99%

Merrifield resin苯甲  99.7%,無級酸酯 98%

Polystyrene resin檸檬酸鉍銨 99%聚烯酸 平均分子量M.W ~3,000

Rink-Amide resin乙酰苯胺 99.95%，升華純化聚烯酸 平均分子量M.W ~1,800

Rink Amide AM resin對氨基偶氮苯 分析標(biāo)準品聚烯酸 平均分子量M.W ~450,000

Trityl chloride resin偶氮熒光桃紅 Dye content 90 %三鈉 97%

Wang resin全反式-β-阿林胡蘿卜 96%三鈉 HPLC，99.0% (T)

Dopamine hydrochloride3-氨基吡啶 分析標(biāo)準品三酐 98%

Fmoc-D-Cys(Trt)-OH氨基蝶呤 98%土霉素  97%

Fmoc-Cys(Acm)-OH草酸高鐵銨 98%硫酸鏈霉素 720 I.U./mg

Fmoc-His(Trt)-OH殺草強  分析標(biāo)準品椰子油 CP

甲磺酸帕珠沙星Deltex-1  (DTX1) (Deltex protein 1)抗原SPINK1/SPINK3  腫瘤相關(guān)胰蛋白酶抑制劑1抗體

甲磺酸帕珠沙星（標(biāo)準品）DISC1(disrupted in schizophrenia1)(NT)  DISC1 N端抗原Spindly/CCDC99  亞砷鹽相關(guān)蛋白抗體

甲磺酸培氟沙星DISC1(disrupted in schizophrenia1)(CT)  DISC1 C端抗原Spindlin 1  卵巢癌相關(guān)蛋白抗體

甲磺酸培氟沙星（標(biāo)準品）DR3/TRAMP (death receptor-3)  DR3 死亡受體（抗原）SPHK2  鞘氨激酶2抗體

培美曲塞二鈉E7 protein/HPV 16 (Human papillomavirus type 16)  人瘤病毒16型E7蛋白抗原SPHK2  鞘氨激酶2抗體

培美曲塞二鈉（標(biāo)準品）EGF-R (Epidemal growth factor receptor)  表皮生長因子受體（抗原）SPHK1  鞘氨激酶1抗體

酞磺胺噻唑Eukaryotic aspartyl protease(Rice)  天冬氨酸蛋白酶家族蛋白(稻蛋白的一種)（抗原）Sphingomyelin Synthase 1  鞘磷脂合成酶1抗體

匹格列酮FAM3B/PANDER(PANcreatic DERived factor)  一種新型的胰島細胞因子(抗原)SPECC1L  細胞質(zhì)和紡錘體機化蛋白A抗體

匹格列酮（標(biāo)準品）Fabp2 (fatty acid binding protein 2, intestinal)  脂肪酸結(jié)合蛋白2(抗原)SPECA  a-包襯蛋白抗體

匹格列酮鹽酸鹽ECG2 (sophagus cancer-related gene-2)  食道癌相關(guān)基因（抗原）SPDYA  細胞周期G2/M期快速誘導(dǎo)蛋白SPDYA抗體
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