細胞凋亡DNA Ladder提取試劑盒(柱式吸附)

商品介紹：

本試劑盒是目前先進的DNA Ladder抽提試劑盒之一。本試劑盒是針對細胞凋亡過程中產生的核小體間DNA鏈斷裂而設計的?？梢苑浅Ｓ行У爻樘嵝∑螢?80-200bp的DNA ladder，同時又可以抽提到大50kb左右的基因組DNA。本試劑盒可以抽提50個樣品。

DNA ladder也稱DNA fragmentation，是細胞凋亡的一個重要指標。通常觀察到DNA ladder，就可以判定細胞發生了凋亡。

樣品首先被蛋白酶K消化，隨后加入適合DNA結合到純化柱上的緩沖液，然后加入到純化柱內。通過高速離心，使DNA在穿過純化柱的瞬間，結合到純化柱上，隨后通過兩次洗滌去除各種雜質，后通過洗脫液把DNA洗脫下來。整個過程無需酚氯仿抽提，無需酒精沉淀，樣品裂解后僅需約15分鐘即可完成。

通過DNA純化柱方式抽提DNA ladder比用傳統的酚氯仿抽提酒精沉淀方法更加便捷，小片段DNA不容易損失。試劑盒提供了RNase A，可以獲得不含RNA的高純度總DNA，排除了RNA對DNA ladder觀察造成的干擾。

本試劑盒每次多可以抽提20mg組織或200-350萬個培養細胞。樣品用量過多，反而會影響抽提效果。純化柱對于DNA的大容量約為30微克。通常每200萬Hela細胞或500萬淋巴細胞可以抽提得到15-25微克總DNA，每25mg肝、腦、腎組織可以抽提得到10-30微克總DNA，每25毫克心、肺組織可以抽提得到5-10微克總DNA，每10mg脾組織可以抽提得到5-30微克總DNA。樣品的用量請勿超過純化柱的容量，樣品用量好能保持在純化柱容量的70%或以下。當然過少的樣品也不利于檢測到DNA ladder。

對于培養細胞的凋亡檢測，通常6孔板一個孔的細胞就足夠用于DNA ladder的抽提和檢測。

試劑盒組份：

樣品裂解液A——————10ml

樣品裂解液B——————11ml

洗滌液I——————21ml(第一次使用前加入7ml無水乙醇)

洗滌液II——————16ml (第一次使用前加入24ml無水乙醇)

洗脫液——————22ml

蛋白酶K——————1.1ml

RNase A——————220μl

DNA純化柱及廢液收集管——————50套

儲存條件：室溫，有效期一年。( 蛋白酶K需-20℃保存)
公司產品僅供科研使用，下列是產品屬性：

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)

操作程序：

注意：最重要的是及時固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC處理，以抑制RNA酶對mRNA的分解作用。此外，過度固定對原位雜交有明顯的不利影響。

1．玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES。切片厚度10-20μm。

2．細胞在多聚賴氨酸處理的蓋玻片上進行培養，條件為37℃和5%的CO2，所用培養基為Dulbecco基礎培養基。細胞長好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分鐘×3次。

3．培養細胞和冰凍切片均可用下述方法固定：固定液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室溫固定 20--30分鐘。蒸餾水充分洗滌，干燥后-20℃冰凍可保存2周以上。

4．30%H2O2 1份+純甲醇50份混合，室溫處理30分鐘。蒸餾水洗滌3次。

5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋1ml 3% 檸檬酸加2滴濃縮型，混勻)，37℃或室溫消化5—120秒鐘。有時也可以不消化。原位雜交用 PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。

6.后固定：消化后才需要。固定液為1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室溫固定 10分鐘。蒸餾水洗滌3次。

7．預雜交：濕盒的準備——干的雜交盒底部加20%甘油20ml以保持濕度。按每張切片20μι加預雜交液。恒溫箱38-42℃2—4小時。吸取多余液體，不洗。

8．雜交——按每張切片20μι雜交液，加在切片上。將原位雜交專用蓋玻片的保護膜揭開后，蓋在切片上。恒溫箱38-42℃雜交過夜(根據雜交情況可以調節)。

9．雜交后洗滌：揭掉蓋玻片，37℃左右水溫的2×SSC洗滌5分鐘×2次；37℃0.5×SSC洗滌15分鐘×1次; 37℃0.2×SSC洗滌15分鐘×1次(如果有非特異性染色，重復0.2×SSC洗滌15分鐘×1-2次)。

10.滴加封閉液：37℃30分鐘。甩去多余液體，不洗

11.滴加化鼠抗*：37℃ 60分鐘或室溫120分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×4次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。

12.滴加SABC：37℃20分鐘或室溫30分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×3次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。

13.滴加化過氧化物酶：37℃20分鐘或室溫30分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×4次。

14.DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒—1ml蒸餾水加顯色劑Ａ，Ｂ，C各一滴，混勻，加至標本上。一般顯色20-30分鐘。若無背景出現則可繼續顯色。也可自配DAB顯色劑后顯色。充分水洗。

15.必要時蘇木素復染，充分水洗。

16.酒精脫水，二甲苯透明，封片。

注意事項：

①加入試劑的順序應一致，以保證所有反應板孔溫育的時間一樣。

②使用干凈的塑料容器配置洗滌液。

③按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。

④底物A應揮發，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應立即讀取OD值。

⑤洗滌酶標板時應充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標反應孔中吸水。

⑥使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。

⑦實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質。

⑧試劑應按標簽說明書儲存，使用前恢復到室溫。稀稀過后的標準品應丟棄，不可保存。

⑨不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。

粘蛋白/粘液1(MUC1)英文名稱：MUC1 ELISA Kit血管生成相關蛋白6抗體包裝1g

再生基因蛋白1a(REG-1a)英文名稱：REG-1a ELISA KitMuellerian繆勒管激抑制因子抗體包裝5g

載脂蛋白H(Apo-H)英文名稱：Apo-H ELISA Kit酪蛋白激受體A8抗體包裝1g

載脂蛋白E(Apo-E)英文名稱：Apo-E ELISA Kit脂肪酰家族成員1抗體包裝5g

載脂蛋白B48(apo-B48)英文名稱：apo-B48 ELISA Kit芳香烴受體核轉錄蛋白樣2抗體包裝100mg

載脂蛋白B100(apo-B100)英文名稱：apo-B100 ELISA Kit磷化芳香N-乙酰化轉移抗體包裝1g

載脂蛋白B100(Apo B100)英文名稱：Apo B100 ELISA Kit肌動蛋白結合蛋白1抗體包裝500mg

載脂蛋白B(ApoB)英文名稱：ApoB ELISA Kit粘附分子IgG樣結構域蛋白2抗體包裝5g

載脂蛋白A5(apo-A5)英文名稱：apo-A5 ELISA Kit肌動蛋白結合蛋白DOC6抗體包裝100mg

載脂蛋白A1(apo-A1)英文名稱：apo-A1 ELISA KitAFG3樣蛋白2/脊髓小腦共濟失調蛋白28抗體包裝500mg

載脂蛋白A1(Apo A1)英文名稱：Apo A1 ELISA Kit激活受體相互作用蛋白1抗體包裝1g

孕受體(PROGR)英文名稱：PROGR ELISA Kit固類還原家族7成員A2抗體包裝5g

孕(PROG)英文名稱：PROG ELISA Kit蛋白激AKT1,2,3抗體包裝25g

孕激/孕(PROG)英文名稱：PROG ELISA Kit帕金森病相關蛋白ATP13A2抗體包裝5g

誘導型一氧化合成(iNOS)英文名稱：iNOS ELISA Kit肌側索硬化蛋白2抗體包裝100g

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